Bmm 251 Microbiologia de Alimentos Normas de segurança e recomendações que deverão ser observadas no laboratório de aulas práticas de Microbiologia




Yüklə 154.29 Kb.
tarix27.04.2016
ölçüsü154.29 Kb.


BMM 251 - Microbiologia de Alimentos

Normas de segurança e recomendações que deverão ser observadas no

laboratório de aulas práticas de Microbiologia

  1. É obrigatório o uso de avental. O avental deve ser de preferência comprido, com mangas longas e deve permanecer abotoado.

  2. Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório.

  3. O material pessoal (bolsas, livros, mochilas estojos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Deixar as bolsas nos armários que ficam no fundo da sala de aula.

  4. Não inicie uma prática sem que tenha lido cuidadosamente as instruções e compreendido os objetivos e modo de execução das experiências.

  5. Checar sempre o nome dos reagentes químicos e culturas microbianas em uso.

  6. Manter qualquer líquido inflamável longe do bico de Bunsen.

  7. Em caso de acidentes (derramamento de culturas, quebra de placas, respingo de cultura, ferimentos, etc):

  • Comunicar imediatamente o pessoal técnico responsável pela aula prática.

  • Colocar papel toalha com álcool 70% sob o material contaminado.

  1. Descarte do material:

  • Material contaminado (pipetas, zaragatoas, lâminas, tubos de diluição e com cultura, etc) deve ser colocado no recipiente próprio para descarte de cada um dos materiais.

  • Material para incubação, previamente identificado por grupo, serão colocados em recipientes próprios.

  • Vidros quebrados devem ser descontaminados separadamente dos demais.

  • Fósforo riscado, algodão e papel utilizado, colocar nas caixas de lixo.

  1. A bancada deve ser desinfetada com álcool 70% antes e após o experimento.

  2. Lavar bem as mãos antes e após a realização do trabalho em bancada.

  3. Culturas, lâminas, reagentes e outros materiais não devem ser removidos do laboratório sem a autorização do responsável.

  4. Não inalar qualquer substância diretamente.

  5. A alça de platina deverá ser flambada antes e depois de ser utilizada, para isso, aquecer até o rubro e deixar resfriar mantendo próxima à chama.

  6. O microscópio é um instrumento valioso e deve ser manipulado e usado cuidadosamente. Qualquer dano ou defeito deve ser comunicado ao professor. No fim de cada aula, limpar a lente ocular e as objetivas com papel macio e guardá-los nos armários.

  1. Identificar todo o material com o número do grupo e data e anotar cuidadosamente os resultados de ser trabalho. Essa anotações servem de base para o aprendizado

Prática 1: Introdução ao trabalho em Laboratórios de Microbiologia




A) Diluições decimais (esquema abaixo)




  1. Com uma pipeta estéril, adicionar a tubos contendo 9 mL de diluente, 1 mL das amostra a ser analisada (diluição 10-1)

  2. Agitar para que haja uma perfeita homogeneização

  3. Com outra pipeta estéril, transferir 1 mL deste tubo para um segundo tubo contendo 9 mL de diluente (diluição 10-2) proceder assim até completar as diluições necessárias para a análise da amostra.












B) Uso correto da alça bacteriológica.

Toda vez que se fizer uma semeadura siga as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura pelos microrganismos presentes no meio ambiente.

A alça bacteriológica deve ser flambada antes e depois de qualquer operação de semeadura até ficar incandescente. Para tanto, deve ser passada na chama e a posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45°C em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.


A seguir, para retirar o material a ser manipulado, esfriar previamente a alça na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri
C) Semeadura de microrganismos em placa, para o isolamento de colônias, utilizando alça microbiológica.

As placas de Petri deverão ser abertas próximas ao bico de Bunsen para evitar contaminação com microrganismos do ar. Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. A técnica de semeadura para isolamento de colônias está demonstrada na figura 1.


D) Semeadura de microrganismos pelo método de espalhamento em placa (“spread plate”)

Alíquota de 0,1 mL de amostra direta ou diluida é inoculada na placa contendo ágar nutriente e depois se espalha essa amostra com a alça de drigalski, previamente esterilizada (forno, por 2 horas a 180°C, ou em autoclave, a 121°C por 30 minutos) ou ainda pode-se fazer uma esterilização imediata mergulhando a alça em álcool absoluto e em seguida passando na chama (3 vezes consecutivas).


E) Semeadura em tubos


Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça. Após a retirada do material com a alça, flambar a alça, após o uso. A técnica está demonstrada na figura 2

F) Uso correto da pipeta


As pipetas utilizadas em microbiologia são preparadas previamente embrulhadas em papel kraft e esterilizadas em forno por 2 horas a 180°C. Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a inferior. (correspondente a ponta da pipeta). Esta sequência evita que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez usada a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro contendo desinfetante.




Prática 3: Semeadura, isolamento e identificação de microrganismos.

As necessidades nutritivas das bactérias são extremamente variáveis. Entre as cultiváveis, em um extremo estão aquelas que só proliferam em substâncias orgânicas, e no outro, as que são capazes de proliferar em substratos inteiramente inorgânicos. Todas as bactérias de importância médica pertencem ao primeiro grupo.

Para que as bactérias possam crescer e multiplicar nos meios de cultura é necessário que disponham de uma fonte de C e um de N; só assim elas podem efetuar a síntese de sua própria matéria orgânica. Mas além das duas fontes mencionadas incorpora-se ao meio de cultura, os chamados fatores de crescimento, representados por certos aminoácidos (triptofano, cistina, etc) e certas vitaminas (complexo B). Estas e outras substâncias que compõe o meio de cultura são o alimento bacteriano, os chamados nutrientes. São substâncias extras celulares que penetram na célula através de sua membrana e são usadas pelos microrganismos para a obtenção de energia e construção de seu “esqueleto”.

Chama-se meio de cultura a um substrato ou uma solução nutriente nos quais os microrganismos são cultiváveis em laboratório. E dá-se o nome de cultura a qualquer crescimento ou cultivo de microrganismo.

Geralmente, quando queremos cultivar uma bactéria de importância médica, usamos meio de cultura complexo, contendo substâncias orgânicas facilmente utilizáveis e, evidentemente, água e íons. A depender das exigências do microrganismo, estes meios podem ser ou não adicionados de sangue e de compostos ricos em vitaminas. O ágar, freqüentemente usado em meios de cultura não tem valor como nutriente. Para o cultivo de qualquer microrganismo deve-se levar em conta ainda à temperatura, o pH e as necessidades respiratórias.

Os meios de cultura usados rotineiramente podem ser de três naturezas: sólidos (ágar comum, ágar sangue, ágar MacConkey, ágar SS); líquidos (caldo de nutriente, caldo glicosado, caldo TSB, etc) e semisólidos (Meio de Tioglicolato)

Os meios utilizados para pesquisar microrganismos também podem ser seletivos e/ou diferenciais.

Meios seletivos são aqueles que permitem o crescimento de apenas um ou alguns grupos de bactérias (Exemplos: Ágar MacConkey, TCBS, Ágar Baird Parker etc)

Meios diferenciais são aqueles que permitem, através da visualização macroscópica, a diferenciação de grupos de microrganismos com características fisiológicas diferentes.

Meios sintéticos ou quimicamente definidos são aqueles cuja composição química é conhecida quantitativamente.

Meios complexos são aqueles cuja composição química é conhecida qualitativamente.
Material


    1. Cultura em ágar inclinado de:

1 - Escherichia coli (G - )

2 – Vibrio cholereae (G - )

3 – Salmonella spp. (G - )

4 – Staphylococcus aureus (G + )



    1. Alça microbiológica

    2. Placas de Petri contendo Ágar Nutriente (AN), Ágar Tiossulfato Citrato Sais Biliares e Sacarose (TCBS), Ágar Verde Brilhante (AVB), Ágar Baird Parker (ABP) e Ágar MacConkey

    3. Tubos contendo meio Ágar Citrato de Simmons

    4. Lâmina de vidro

    5. Água oxigenada 30% (Prova Catalase)

Prova da Catalase serve para observar a capacidade que determinados microrganismos têm de desdobrar o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio livre e que se traduz pela formação de bolhas quando à cultura se adiciona água oxigenada. As bactérias anaeróbias não produzem Catalase .



Técnicas

    • Semear cada microrganismo em meio comum e em meio seletivo.

    • Semear os microrganismos 1, 2, 3, e em Ágar Citrato Simmons

    • Incubar as culturas semeadas em estufa a 35°C por 24 horas

    • Prova Catalase –

      1. Adicionar 5 gotas de água oxigenada 30% ao tubo contendo a cultura 4

      2. Verificar se há produção de bolhas durante os primeiros 5 minutos




Microrganismo

Placas

Meio em tubo

Meio comum

Meio seletivo

E. coli

AN

MacConkey

A.citrato

V. cholerae

AN

TCBS

A.citrato

Salmonella spp

AN

AVB

A.citrato

S. aureus

AN

ABP

Prova catalase

Leitura

Microrganismo: #

Características no meio comum




Características no meio seletivo em placa




Características no meio em tubo




Prova catalase





Composição dos meios de cultura usados no curso


Ágar Verde Brilhante - g/L

Baird-Parker - g/L

Ágar MacConkey / g/L

Proteose peptone 10

Triptona 10

Peptona 20

Extrato de levedura 3

Exrato de carne 5

Lactose 10

Lactose 10

Extrato de levedura 1

Sais biliares 1,5

Sacarose 10

Pyruvato de Sódio 10

Cloreto de sódio 5

Cloreto de sódio 5

Glicina 12

Vermelho Neutro 0,05

Vermelho de fenol 0,08

Cloreto de litium 5

Cristal violeta 0,001

Verde brilhante 0,0125

Emulsão de gema de ovo

Ágar 13,5

Ágar 13

Telurito de potássio 0,05

pH 7,1 ± 0,2 a 25°C

pH 6,5 ± 0,2 a 25°C

Agar 15







pH 6,8 ± 0,2 a 25°C













Ágar Nutriente – g/L

Agar TCBS – g/L

Ágar Citrato de Simmons – g/L

Extrato de Carne 1g

Extrato de levedura 5g

Sulfato de magnésio 0,2g

Extrato de levedura 2g

Peptona bacteriológica 10g

Fosfato de amônio 1g

Peptona 5g

Citrato de sódio 10g

Fosfato dipotássico 1g

Cloreto sódio 5g

Cloreto de sódio 10g

Citrato de sódio 2g

Ágar 15g

Azul de bromotimol 0,04g

Cloreto de sódio 5g

pH 6,5 ± 0,2 a 25°C

Tiosulfato de sódio 10g

Azul de bromotimol 0,08g




Bile 8g

Agar 15g




Sacarose 20g

pH 6,6 ± 0,2 a 25°C




Citrato férrico 1g







Azul de timol 0,04g







Ágar 15g







pH 8,6 ± 0,2 a 25°C






Indicadores de ácidos e bases




Faixa de viragem - pH

Mudança de cor

Azul de bromotimol

6,0 – 7,6

Amarelo - azul

Azul de timol

8,0 – 9,6

Amarelo - azul

Vermelho de fenol

6,4 – 8,2

Amarelo – vemelho

Vermelho Neutro

6,8 – 8,0

Vermelho – amarelo

Prática 4: Coloração de Gram





  • Introdução:

A maioria dos microrganismos não apresenta cor quando observados ao microscópio óptico. Para serem visualizados, com maior clareza, eles devem ser corados. Existem inúmeros métodos para coloração. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama.

Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Um desses íons, o que dá a cor é chamado de radical cromóforo. Então, os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo, enquanto que os corantes ácidos têm a cor do seu íon negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada, portanto atrai corante básico. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno e safranina.

A introdução de colorações no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais:


  1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são revelados apenas o contorno e a conformação dos arranjos;

  2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares;

  3. Podem levar a diferenciação entre os grupos de microrganismos;

  4. Podem, eventualmente, identificar alguns grupos.



Quanto aos tipos de coloração temos:





  1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.

  2. Coloração diferencial – nesta coloração o corante reage diferencialmente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool – ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais.

  3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.

No processo de coloração podem ser usadas substâncias, que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.

Coloração de Gram

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holandês Hans Cristian Gram. Esta coloração é uma das mais importantes e é rotineiramente utilizada no laboratório de Microbiologia. Ela divide as bactérias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas, além de permitir o estudo da célula bacteriana quanto à sua morfologia (cocos ou bacilos) e arranjo.

Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo), enquanto as que não retém o complexo cora-se em vermelho (Gram negativo).

A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias Gram (+) e Gram (-).

Bactérias Gram (+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram (-). Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente, e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CV-Iodo, que é maior que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células de Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem azuis.

Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptídeoglicano, que não consegue reter o complexo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e aparecem em vermelho.

A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular, mas sim com sua estrutura física, o que confere a característica de positividade ao Gram. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente realizada e interpretada.



Coloração de cápsula - Método de Hiss - A parede celular de certas bactérias é cercada por um envoltório viscoso, chamado de cápsula que pode ser evidenciado por métodos especiais de coloração, como o método de coloração de Hiss.




Coloração de esporos – Método de Wirtz - Os esporos são formas de resistência de algumas bactérias que se apresentam como corpúsculos ovóides ou esféricos livres ou no interior da célula bacteriana. Só se coram por métodos especiais, tais como Wirtz, Moeller, etc.





  • Objetivo

O objetivo desta prática é demonstrar a importância das colorações e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir formas e arranjos.

Coloração de Gram

  • Sobre uma lâmina de vidro, colocar uma gota de água. Com a alça de platina tocar levemente na superfície da colônia e emulsionar o material na gota de água (caso o microrganismo seja fornecido em suspensão, colocar uma gota desta sobre a lâmina). Deixar secar.

  • Passar o esfregaço na chama do bico de Bunsen três vezes a fim de fixar o material.

  • Cobrir o esfregaço seco com violeta genciana e deixar por 1 minuto.

  • Esgotar a lâmina e cobrir com solução de lugol e deixar 1 minuto.

  • Esgotar a lâmina e, mantendo a mesma inclinada, pingar gotas de álcool até que não se desprenda mais corante da preparação.

  • Lavar com água corrente.

  • Cobrir a lâmina com solução de safranina e deixar por 30 segundos.

  • Lavar a lâmina e cobrir com papel de filtro.

  • Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão.

    1. Observar ao microscópio, com objetiva de imersão, as preparações indicadas.

    2. Desenhar e identificar, nos espaços abaixo, as observações microscópicas
















Nome:

Forma:


Arranjo das células:




Nome:

Forma:


Arranjo das células




Nome:

Forma:


Arranjo das células

Cor:

Gram:





Cor:

Gram:





Cor:

Gram:





























Nome:

Forma:


Arranjo das células:




Nome:

Forma:


Arranjo das células:




Nome:

Forma:


Arranjo das células:

Cor:

Gram:





Cor:

Gram:





Cor:

Gram:



Prática 5:Isolamento e morfologia geral de fungos





    • Introdução:

A identificação dos fungos é, em grande parte, baseado em sua morfologia. Como eles habitam os mais variados substratos, apresenta em decorrência uma variação de tipos morfológicos, dos mais simples aos mais complexos. Considera-se no seu estudo, aspectos da morfologia macroscópica (colônias filamentosas, cremosas, cotonosas, pulverulentas, formação de pigmentação, etc) como também da morfologia microscópica.

A unidade estrutural dos fungos é representada pela hifa, e o conjunto destes elementos é denominado micélio. O micélio vegetativo exerce as funções de assimilação de alimentos e fixação em substratos, podendo se diferenciar em estrutura de frutificação que serve à reprodução.

Micélio Vegetativo

Constituído por um aglomerado de hifas, pode ser dividido de acordo com sua morfologia em três tipos:



  1. Unicelular: caracteriza as leveduras que são constituídas por células arredondadas, ovóides ou ligeiramente alongadas e que podem se reproduzir por brotamento, cissiparidade ou por outros processos.

  2. Filamentoso: caracteriza os bolores, podendo apresentar-se septado ou cenocítico. As hifas podem se diferenciar em estruturas e funções variáveis recebendo, então, denominações diversas: rizóides, apressórios, anastomoses, hifas artrosporadas, etc.

  3. Pseudomicélio: caracteriza um gênero de levedura (Candida). É formada de brotamentos sucessivos de células em determinadas condições de cultivo.

Micélio de Frutificação ou Endocarpio

Cumpre as funções de preservação e disseminação da espécie mediante a formação de células especiais denominadas esporos, que são elementos de resistência. Estes podem ser hialinos, pigmentados, simples, septados apresentando várias formas características que definem, às vezes, gêneros ou espécies de fungos.

Os esporos, de acordo com sua origem, podem ser assexuados ou sexuados e tanto um como outro podem estar ou não no interior de determinadas estruturas.

Esporos de origem assexuada



  1. Ectosporos: esporos que se formam na extremidade de hifas especiais denominadas conidióforos. Esses esporos são denominados conídios. Ex.: Aspergillus, Penicillium.

  2. Endosporos: esporos produzidos no interior de estruturas denominadas esporângios. Os esporos, nesses casos, são denominados esporangiósporos. Ex.: Rhizopus

Esporos de origem sexuada

  1. Ectosporos: esporos formados na extremidade de basídios denominados basidiósporos. Ex.: Basidiomicetos

  2. Endosporos: esporos no interior de células denominadas ascos. Os esporos, nesse caso, são denominados ascósporos. Ex.: Piedraia hortai.

Prática

Fungos estudados: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Candida sp.



A. Estudo da morfologia macroscópica

Descreva os aspectos macroscópicos característicos: tipo de colônia, verso,reverso, pigmentação, tamanho, etc.

Observe a diferença entre um bolor e uma levedura

Obtenção de Colônia Gigante:

Técnica: Utilize placas de Petri com 20 mL de ágar Sabouraud. Com alça de platina previamente imersa em água destilada estéril, toque a superfície da colônia (caso esporulalada) ou retire um fragmento pequeno e semeie um ponto no centro da placa. Cultive a temperatura ambiente. Quando o crescimento estiver satisfatório submeta à ação do formol. Descreva os aspectos macroscópicos característicos (verso e reverso).



B. Estudo da morfologia microscópica

Retire um pequeno fragmento da colônia e coloque entre lâmina e lamínula com uma gota de lactofenol azul algodão. Examine os aspectos microscópicos característicos: micélio septado ou cenocítico, órgãos de frutificação, etc. Observe a diferença microscópica entre bolor e levedura.



C. Microcultivo de fungos

Técnica: Utilize placas de Petri contendo lâminas de microscopia dispostas sobre bastão de vidro em “U”. Coloque, com todo cuidado de assepsia, pequeno quadrado (1cm) de ágar Sabouraud a 2% em camada fina, sobre a lâmina. Com alça de níquel-cromo, semeie os lados do citado quadrilátero com o fungo a ser cultivado. Coloque uma lamínula e previamente flambada sobre o referido meio. Adicione na placa água destilada para evitar dessecamento do meio. Date e incube a temperatura ambiente. Quando houver crescimento satisfatório submeta à ação do formol (0,5 mL por 60 min), retire a lamínula bem como o fragmento do meio de cultura. A lâmina e a lamínula serão submetidas à ação de um fixador (álcool 70%). Segue-se coloração com lactofenol azul algodão e lutagem com esmalte incolor.

Examine, cuidadosamente, os órgãos vegetativos e de frutificação do fungo cultivado, fazendo desenhos de suas estruturas principais.

Aspectos Microscópicos:







Questões




  1. Como diferenciar macro e microscopicamente bolores e leveduras?

  2. Esquematizar e indicar (nomear) as estruturas de um fungo filamentoso (bolor) e de uma levedura.

  3. Qual a finalidade do método da colônia gigante e do microcultivo para a caracterização de fungos?



Prática 6: Resistência a drogas - Antibiograma - Conjugação bacteriana


Resistência a drogas

Introdução:

Antibiograma é um teste que permite a verificação “in vitro” da sensibilidade de uma bactéria aos antibióticos. Esta sensibilidade é demonstrada pela zona ou halo de inibição de crescimento que se forma em volta do disco de antibiótico. De acordo com o tamanho do halo de inibição, diz-se que a bactéria é sensível, pouco sensível ou resistente (quando não forma halo).



Objetivos: testar a sensibilidade dos microrganismos frente a antibióticos

Material:

  • Cultura em meio sólido: E.coli e S.aureus

  • Placas de Petri contendo Ágar Muller Hinton

  • Discos de antibióticos: Ampicilina (10mcg), Tetraciclina e Gentamicina (30mcg)

Técnica

  1. Depositar 0,1 mL da cultura (108 UFC/mL) no centro da placa de petri;

  2. Espalhar uniformemente com a alça de Drigalski ou “swab”;

  3. Deixar secar a superfície;

  4. Colocar os discos de antibióticos usando pinça;

  5. Incubar a 37oC durante 24 horas;

  6. Ler e registrar os resultados (verificar se há ou não halo de inibição de crescimento em torno de cada disco).

Leitura

Com o auxílio da tabela abaixo, ler e registrar os resultados (verificar se há ou não halo de inibição de crescimento em torno de cada disco), em placas semeadas com culturas de E. coli e S. aureus frente a alguns antibióticos.




Antibiótico

Microrganismo

Resistente

Intermediário

Sensível

Ampicilina (10 mcg)

E.coli

 13 mm

14 – 16 mm

 17 mm

S.aureus

 28 mm

-

 29 mm

Gentamicina (10 mcg)

E.coli e S.aureus

 12 mm

13 – 14 mm

 15 mm

Tetraciclina (30 mcg)

E.coli e S.aureus

 14 mm

15 – 18 mm

 17 mm



Prática 6 : B - Conjugação

Introdução: Conjugação e mecanismo de transferência de informação genética que requer contato entre as células. Este intercâmbio implica transferência de molécula de DNA, um plasmídio.

A transferência compreende quatro estágios:

  1. Formação de uma união específica doador receptor (contato efetivo).

  2. Preparação para transferência do DNA (mobilização)

  3. Transferência do DNA

  4. Formação de um plasmídio funcional replicativo no receptor

Os veículos mais usados são:

Plasmídeos pequenos, pequenas moléculas de DNA circular encontradas em eubactérias e outros organismos.

A molécula de DNA pra ser um vetor funcional precisa de:


  1. Capacidade de replicação no hospedeiro

  2. Ter um tamanho pequeno ideal <10kb

  3. Possuir uma marca de seleção (geralmente uma resistência a um antibiótico)

Objetivo


Demonstrar a transferência da resistência a antibióticos pela passagem de plasmídeo de uma bactéria para outra por conjugação

Material

Swabs estéreis

Palitos de dente estéreis

Cultura de E.coli contendo o plasmídeo pVK100 (confere à tetraciclina e canamicina)



Cultura de Burkholderia sp sensível a tetraciclina e canamicina capaz de crescer em meio mineral

Procedimento

  1. Semear a E.coli e Burkholderia, isoladamente em placas LBT, MMG e MMGT (usar metade da placa para cada bactéria

  2. Na segunda placa de MMGT com auxílio de swab, espalhar uniformemente a culturas de E.coli e esperar secar. Hostilizando o palito esterilizado, pegar uma pequena quantidade de uma colônia da placa de Burkholderia semeando ao acaso em diferentes regiões da placa sobre a qual foi espalhada a cultura de E.coli

Incubar a 30°C por 24 – 48 horas

Tabela de resultados

















LBT

MMG

MMGT

MMGT



Meios de cultura

Plasmídeo

Meio mineral com glicose




glicose 10g/100mL

Na2HPO4 3,5gL

K2HPO4 1,5g/L

(NH4)2SO4 1,0g/L

MgSO4.7H2O 1mL(205) 1mL/L

CaCl2.2 H2O (1%) 1mL/L

Citrato de ferro amoniacal (6%) 1mL/L

Elementos traços

Luria Bertani

Triptona 10 g /L

Extrato de levedura 5g/L

NaCl 5g/L

Agar 20g/L

Prática 9: Isolamento de Microrganismos da Microbiota da Água, Solo e do Homem


    • Introdução

As bactérias, assim como outros microrganismos apresentam importante atividade em águas doces, águas de aquários e água do mar. Muitos deles são autóctones do ambiente aquático, outros são organismos de trânsito, que chegaram ao ambiente aquático através do ar, solo ou despejos industriais e domésticos. Tais organismos são de suma importância uma vez que, podendo afetar a saúde do homem e outros animais, ocupam uma posição chave na cadeia alimentar e reciclam os elementos do meio através de sua participação nos ciclos bioquímicos.

A urbanização e conseqüentemente a crescente demandam de água para as comunidades, a criação de organismos aquáticos para comercialização e outros fatores, mostram cada vez mais a importância da microbiologia aquática.

Já a microbiota do ar é transitória e variável, uma vez que o número e os tipos de agentes contaminantes do ar, são determinados pelas várias fontes da contaminação existentes no meio ambiente. Embora o ar não seja um ambiente propício para o desenvolvimento de bactérias e outros microrganismos, eles podem estar presentes em suspensão, em material particulado e gotas de água, podendo portanto, ser transportado para vários lugares através de ventos e massas de ar onde, eventualmente, microrganismos patogênicos podem estar presentes.

Em relação a microbiota do solo poucos ambientes na terra fornecem tão grande variedade de microrganismos como o solo fértil. Bactérias, fungos, algas, protozoários e vírus formam esta coleção.

A microbiota dos alimentos pode fornecer informações concernentes à qualidade da matéria prima e as condições sanitárias sob as quais foram processados.


Atividade 1


A. Ar atmosférico (2 grupos: jardim e banheiro)


  1. Expor ao ambiente durante 15 minutos, placas de Ágar Sabouraud + cloranfenicol e ágar nutriente;

  2. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (Agar Nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (Agar Sabouraud);

  3. Contar as colônias.


B. Alimento (milho) – (semeadura em superfície)


  1. Pesar 1 grama da amostra previamente moída;

  2. Transferir para tubos contendo 9 mL de água estéril;

  3. Misturar bem a suspensão;

  4. Deixar em repouso por 10 minutos;

  5. Semear 0,1 mL do sobrenadante em placas contendo Ágar Sabouraud dextrose +cloranfenicol e em placas contendo Ágar Nutriente;

  6. Espalhar, com alça de Drigalski, o material semeado;

  7. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (Ágar Nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (Ágar Sabouraud);Contar as colônias.
C. Solo (semeadura em superfície)




  1. Pesar 1 grama de solo;

  2. Transferir para tubos contendo 9 mL de água estéril;

  3. Misturar bem a suspensão;

  4. Deixar em repouso por 10 minutos;

  5. Semear 0,1 mL do sobrenadante em placas contendo Ágar Sabouraud dextrose+cloranfenicol e em placas contendo Ágar Nutriente;

  6. Espalhar, com alça de Drigalski, o material semeado;

  7. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (Ágar Nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (Ágar Sabouraud);

  8. Contar as colônias.


D. Água de abastecimento público (semeadura em profundidade)


  1. Deixar escorrer a água por 2 a 3 minutos;

  2. Colher 20 mL de água em tubo esterilizado;

  3. Semear 1 mL em placas contendo Ágar Sabouraud dextrose+cloranfenicol e em placas contendo ágar nutriente;

  4. Homogeneizar esperar solidificar;

  1. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (ágar nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (ágar Sabouraud);

  1. Contar as colônias .

E. Água de lago (semeadura em superfície)

  1. Colher 20 mL de água em tubo esterilizado;

  2. Semear 0,1 mL em placas contendo ágar Sabouraud dextrose+cloranfenicol e em placas contendo ágar nutriente;

  3. Espalhar, com alça de Drigalski, o material semeado;

  4. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (ágar nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (ágar Sabouraud);

  5. Contar as colônias.


F. Material diverso (dinheiro, balcão, avental, etc.). - (semeadura em superfície)

  1. Umedecer 2 zaragatoas em solução salina. Usando um molde, esfregue a superfície do material a ser estudado;

  2. Voltar com a zaragatoa para o tubo de salina, cortar a haste com a tesoura para que a zaragatoa mergulhe no líquido. Deixar em contato por 15 minutos. Agitar vigorosamente;

  3. Semear 0,1 da suspensão (zaragatoa + salina) em placas contendo ágar nutriente e 0,1 mL em placas contendo ágar Sabouraud dextrose+cloranfenicol;

  4. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (ágar nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (ágar Sabouraud);

  5. Contar as colônias.


G. Fossas nasais (semeadura em superfície)

  1. Umedecer 2 zaragatoas em solução salina e esfregue na superfície do material a ser estudado;

  2. Passar as zaragatoas na superfície das placas de ágar Sabouraud e ágar nutriente;

  3. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (ágar nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (ágar Sabouraud);

  4. Contar as colônias.



H. Pele e mãos (semeadura em superfície)

  1. Umedecer 2 zaragatoas em solução salina e esfregue na superfície do material a ser estudado;

  2. Passar as zaragatoas na superfície das placas de ágar Sabouraud e ágar nutriente;

  3. Incubar as placas a 37°C por 24 – 48 horas para bactérias (ágar nutriente) e a 25°C por 3 – 5 dias para fungos (ágar Sabouraud);

  4. Contar as colônias.


Leitura:

    • Analisar seus resultados e comparar com os resultados obtidos entre os diversos materiais colhidos.

    • Analisar as metodologias usadas na prática.


Prática 8 – Transmissão de microrganismos por contato
Introdução
As doenças contagiosas, da palavra latina contagium, que significa toque ou contato, podem ser transmitidas por contato direto pessoa-pessoa ou por água, ar e alimentos. Os apertos de mãos e os beijos podem transmitir microrganismos patogênicos. Alguns exemplos de doenças transmitidas desta maneira incluem a poliomielite, a varicela e as infecções estreptocócicas.

O contato direto com lesões infectadas, como feridas abertas, furúnculos e abscessos drenados obviamente são um caminho aberto e um perigo em potencial para adquirir e transmitir o agente infeccioso envolvido.

Certamente, a lavagem das mãos após assuar o nariz, defecar, urinar ou trabalhar com pessoas infectadas contribui para impedir a disseminação de agentes infecciosos. Em um ambiente hospitalar a lavagem das mãos antes e após a manipulação de pacientes é uma atitude necessária para evitar infecções hospitalares.

Material


Fermento biológico 10 gramas

Erlenmeyer contendo 100 mL água destilada estéril

Zaragatoas estéreis

Placa contendo ágar Sabouraud dextrose


Método

Dividir o fundo das placas de Petri em 4 partes iguais. Cada parte para um aluno.

Derramar a suspensão de fermento nas mãos do aluno no 1 (iniciador da cadeia epidemiológica). A seguir o aluno deverá espalhar homogeneamente a suspensão entre as palmas das mãos.

A -Transmissão direta (grupo 1)

O aluno no 1 deverá apertar a mão de outro colega (vizinho imediato) e assim sucessivamente até completar uma cadeia epidemiológica composta por no máximo 8 componentes (8 “rounds” de apertos de mão).

Após finalizar os apertos de mãos, cada aluno deverá umedecer uma Zaragotoa em solução fisiológica estéril, esfregar na palma da mão contaminada e semear nos respectivos quadrantes da placa de petri.

Colocar as placas identificadas na estufa a 25oC até o dia seguinte.



B - Transmissão indireta (grupo 2/grupo3)

O aluno no 1 deverá molhar a mão na suspensão de fermento e em seguida colocar a mão sobre uma superfície (bancada, maçaneta) O aluno n°2 deve colocar a mão sobre essa mesma superfície e em seguida deve apertar a mão do aluno nº. 3 e a partir desse ponto segue o experimento como exposto no item A


C - Interrupção da cadeia epidemiologia (grupo 4/grupo5)

O aluno no 1 deverá apertar a mão de outro colega (vizinho imediato) o aluno n°2

O Aluno nº. 2 deve lavar a mãos com sabonete e álcool, e a partir desse ponto segue o experimento como exposto no item A


experimento

Alunos

1

2

3

4

5

6

7

8

A

























B

























C


























Prática 9 - Contagem de fungos em alimentos

Introdução

Todos os alimentos, independentes de sua origem, apresentam uma microbiota natural extremamente variável, concentrada principalmente na região superficial. Particularmente, os bolores as leveduras e as bactérias são microrganismos de maior destaque, tanto como agentes potenciais de deterioração, como eventuais patógenos do homem. Ao lado da microbiota natural, nas diversas etapas do processamento, os alimentos estão sujeitos à contaminação por diferentes microrganismos, provenientes da manipulação inadequada, superfícies e utensílios não desinfetados ou provenientes da atmosfera ambiental.

Os principais fatores que influenciam o crescimento dos fungos (bolores e leveduras) no armazenamento dos produtos são: tipo de substrato, umidade (atividade de água), pH, taxa de oxigenação, tempo de armazenamento, umidade relativa do ar, danos mecânicos, presença de insetos e interações microbianas. Entre esses fatores, tem-se observado que o tipo de substrato, a umidade e a temperatura são os mais importantes.

Tendo em vista a possibilidade da avaliação das condições de armazenamento dos alimentos em relação à contaminação por fungos, através da pesquisa da microbiota fúngica, este experimento tem como objetivo isolar e quantificar a microbiota fúngica em 2 diferentes substratos (alimentos) com diferentes valores de umidade (atividade de água).




Material





  • 1 grama de alimento moído (milho e amendoim)

  • Tubos contendo meio de ágar Batata-Dextrose

  • Pipetas de 1 mL

  • Tubos contendo o diluente (água destilada estéril)

  • Alça de Drigalski


Procedimento





  1. Pesar 1 grama do alimento a ser analisado;

  2. Colocar o material em tubos contendo 9 ml de água tamponada estéril (diluição 10-1);

  3. Transferir 1 ml para um tubo contendo 9 ml de água tamponada (diluição10-2);

  4. Inocular 0,1 ml de cada diluição em placas contendo ágar Batata-Dextrose;

  5. Espalhar com alça de Drigalski;

  6. Incubar as placas em estufa a 25°C por 5 dias;

  7. Contar as placas, que tenham entre 25 a 250 UFC.


Resultados:


Para se obter o número de unidades formadoras de colônias por grama do substrato,. multiplica-se o número de colônias obtidos pelo fator de diluição e divide-se o resultado pelo volume inoculado na placa.





Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©www.azrefs.org 2016
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə